【摘要】電筒音樂香風(fēng)自動(dòng)傘包括傘桿、傘骨架、傘棚布、 電筒傘柄，在傘桿上部裝有微型電機(jī)，裝有音響集成 元件、固體香料和活動(dòng)葉片的電子音響盒與微型電機(jī) 軸相連，用干電池或充電電池做能源驅(qū)動(dòng)微型電機(jī)轉(zhuǎn) 動(dòng)和音響集成元件發(fā)聲，高速旋轉(zhuǎn)的葉片產(chǎn)生的
【摘要】 本發(fā)明涉及克隆有人腫瘤壞死因子-α基因的變 鉛青鏈霉菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明方法采用基因工程 技術(shù)，以質(zhì)粒PIJ486為載體，其中包括通過T4-DNA 連接酶將分別用EcoRI-HindIII雙酶切得到的質(zhì)粒 PHTITNFcDNA片段和質(zhì)粒PIJ486片段進(jìn)行連接，通 過轉(zhuǎn)化使其克隆至變鉛青鏈霉菌TK54，挑選轉(zhuǎn)化 子，提取重組質(zhì)粒，得到No7轉(zhuǎn)化子，獲得了克隆有 人腫瘤壞死因子-α基因的變鉛青鏈霉菌TK54-HT (含有重組質(zhì)粒PIJT7)，將該克隆菌株進(jìn)行發(fā)醇培養(yǎng)， 即可獲得腫瘤壞死因子蛋白，其表達(dá)水平可達(dá)1×107 單位/升以上，菌種遺傳性穩(wěn)定。 【專利類型】發(fā)明申請 【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 【申請人類型】科研單位 【申請人地址】100050北京市天壇西里1號(hào) 【申請人地區(qū)】中國 【申請人城市】北京市 【申請人區(qū)縣】東城區(qū) 【申請?zhí)枴緾N91103105.7 【申請日】1991-05-17 【申請年份】1991 【公開公告號(hào)】CN1055200A 【公開公告日】1991-10-09 【公開公告年份】1991 【授權(quán)公告號(hào)】CN1037009C 【授權(quán)公告日】1998-01-14 【授權(quán)公告年份】1998.0 【IPC分類號(hào)】C12N15/09; C12P21/02; C12N15/64 【發(fā)明人】李元; 劉菊萍; 李煥婁; 石蓮英; 劉伯英 【主權(quán)項(xiàng)內(nèi)容】1、克隆有人腫瘤壞死因子-α(TNF)基因的變鉛青鏈霉菌的構(gòu)建方法，其中包括酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑選轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒和經(jīng)確證后得到所需菌種五個(gè)步驟，其特征在于： a、連接：以質(zhì)粒PIJ486為載體，將經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRI-HindⅢ雙酶切得到的質(zhì)粒PHT1TNFcDNA片段和經(jīng)過限制性內(nèi)酶EcoRI-HindⅢ雙酶切得到的質(zhì)粒PIJ486片段相連接，cDNA片段濃度和載體DNA濃度比為3～5∶1，加入T4DNA連接酶，于10～14℃放置3小時(shí)以上進(jìn)行連接，獲得重組DNA分子； b、轉(zhuǎn)化：采用上述a步驟中連接后的重組DNA，以變鉛青鏈霉菌TK54的原生質(zhì)體為受體，按照Hopwood等人的方法，將連接后的DNA轉(zhuǎn)化至所說的受體菌中； c、挑選轉(zhuǎn)化子及提取重組質(zhì)粒：以含新霉素30μg/ml的R2瓊脂平板挑選含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，凡是挑選出來的耐藥菌落多為含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，采用Katz的快速堿變性方法提取含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，將瓊脂糖凝膠電泳后確定為重組質(zhì)粒的樣品再用EcoRI-HindⅢ酶切后的DNA片段與在同一瓊脂糖凝膠電泳平板上泳動(dòng)的入噬菌體DNA限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切片段的距離進(jìn)行比較從而確定各片段分子量大小，其中№7轉(zhuǎn)化子所含重組質(zhì)粒PIJT7插入片段為615bp與TNFcDNA相同，經(jīng)L929細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)和SDS-聚丙酰胺凝膠電泳確證：№7轉(zhuǎn)化子為人腫瘤壞死因子-α的基因工程菌。 【當(dāng)前權(quán)利人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 【當(dāng)前專利權(quán)人地址】北京市天壇西里1號(hào) 【統(tǒng)一社會(huì)信用代碼】12100000400819808G
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